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单克隆北京抗体制备过程有哪些步骤?

时间:2022-5-3 3:00:00  来源:http://bj.saiboerbio.com/news801748.html

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北京单克隆抗体制备过程

  1. 免疫动物

  免疫动物使用抗原免疫小鼠产生致敏性B淋巴细胞的过程。一般选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠,按照预先制定的免疫计划进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖,并分化成为致敏B淋巴细胞。

  2.细胞融合

  用二氧化碳气体处死小鼠,取出脾脏进行无菌操作,挤压和研磨平坦的容器,制备脾细胞悬浮液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合,并添加促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇的作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞。

  3.选择性培养

  选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一般采用HAT选择性北京培养基HAT在培养基中,未融合的骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶不能通过补救合成DNA死亡。未融合的淋巴细胞有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶本身不能在体外长期存活,并逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞从脾细胞中获得次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶具有骨髓瘤细胞无限增殖的特点,因此可以HAT在培养基中生存和增殖。

  4.杂交瘤阳性克隆的筛选和克隆化

  在HAT在培养基中生长的杂交瘤细胞中,只有少数是分泌特异性北京单克隆抗体的细胞,因此必须进行筛选和克隆。杂交瘤细胞的克隆培养通常采用有限的稀释方法。通过敏感、快速、特殊的免疫方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩张。免疫球蛋白类型、亚、特异性、亲和力、抗原表面及其分子量后,及时冷冻。

  5.单克隆抗体的大量制备

  大量单克隆抗体的制备主要采用动物诱生法和体外培养法。

  (1)取体内诱生法 BALB/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml预处理液体石蜡或降植烷。1-2杂交瘤细胞在腹腔内接种。小鼠腹腔内杂交瘤细胞增殖,产生并分泌单克隆抗体。1-2周,可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,即可获得大量单克隆抗体。

  (2)体外培养法 将杂交瘤细胞放入培养瓶中进行培养。在培养过程中,杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,获得所需的单克隆抗体。但该方法产生的抗体量有限。各种新的培养技术和设备不断出现,大大提高了抗体的产量。

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