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关于北京IgM纯化你了解多少?它的实验步骤又是什么呢!

时间:2020-4-7 3:00:00  来源:http://bj.saiboerbio.com/news347039.html

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大多数IgM类北京抗体是优球蛋白不溶于水,故可用双蒸水透析IgM纯化。对那些溶于水的IgM类北京抗体可用饱和硫酸铵沉淀。沉淀后可以采用颗粒排斥层析法(凝胶过滤)进一步将IgM纯化。

颗粒排斥层析(size-exclusion chromatography)法又称分子筛层析或凝胶过滤,是利用微孔凝胶分离不同大小分子的北京抗体,可用于IgM纯化样品中IgG和IgM的分离,常用于对硫酸铵粗提物的进一步纯化。通过该法纯化所得抗体可用于Ig分子片段的制备、FITC、生物素或同位素标记。


一、IgM纯化需要的材料和试剂

1. 抗血清,杂交瘤腹水或其上清,硫酸铵沉淀粗提γ球蛋白。

2. 含0.02%NaN3 的硼酸缓冲液,PBS。

3. 透析袋;26mm×900mm层析柱。

4. 适当筛孔的颗粒排斥(SE)凝胶(AcA Ultragel-或Sephacryl S-200(Pharmacia LKB)。

5. 蛋白透析、SE层析和SDS-PAGE所需的其他试剂和器材。

二、IgM纯化的操作步骤

1. 待提取样品11,000~13,000r/min(15,000~20,000×g),4℃或室温离心,除沉淀。

2. 上清液对双蒸水透析4℃24h。

3. 11,000~15,000r/min 4℃ 或室温离心1h,留沉淀。

4. 制备SE凝胶层析柱,以硼酸缓冲液平衡。

5. 将步骤3沉淀或饱和硫酸铵粗提γ球蛋白以3~5ml硼酸缓冲液溶解,缓慢加样。

6. 以硼酸缓冲液洗脱蛋白质,并收集100管(每管为柱床体积的1%),IgM在洗脱液的di一个蛋白峰。

7. 收集Ig蛋白峰,分别合并,透析浓缩,紫外分光光度计OD 280nm测定Ig含量,SDS-PAGE鉴定IgM纯度。

8. 以1~20mg Ig/ml硼酸缓冲液置4℃或-70℃保存。

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